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遺伝子迅速スクリーニング法


　弊社では、BAC/PACライブラリーのスクリーニングと物理地図作成で、ヒトゲノムプロジェクトに貢献してきました（ヒト1p36-33 BAC地図）。この経験を基に新規のゲノムライブラリーからその日のうちに目的クローンの単離する技術を開発しました（The Day Screening）。このためのPCR用のDNAスーパープールの作成、これをキット化したスクリーニングプレート、縦横溝プレートを受託しております。

●　"The Day Screening"（即日スクリーニング法）の工程図

[BAC／PACスクリーニング反応]

１. STSの確定
1） 発注したオリゴを蒸留水で100 pmol/ulに溶かし、プライマー原液とし、 プライマー・セットの原液箱（-20℃）に保存する。
2） 原液を10倍 (10 pmol/ul)に希釈し、作業用プライマーとする。
3） ヒト胎盤(あるいはマウス)DNA (0.2 ug)を用いてPCRを行い、設計した 　プライマー・セットから予想されるPCR産物と同じ産物が得られるかどうかを確認し、PCRの条件（プライマーのシークエンス、アニール温度、PCR 産物分子量等）を確定する。

２. 第1段階PCR（スクリーニング・キットによるMTPプレートの選択）
1） 確定したプライマー・セットの入ったPCRカクテル100反応分を作製する(表１)。
2） 5枚のPCRキット（スクリーニング・キット）の中から1枚を選び、プレート番号表を印刷したシールを静かに除去し、PCRカクテルを20ulずつ分注する。
3） 同封したPCR粘着シートをプレートに密着させ、至適Tmのホットスタート・プログラムでPCR反応を行う。
4） 反応後、5ulのダイマーカーを加え、1xTAEバッファーで150V, 20分間の2.5%アガロース電気泳動を行う（日本エイドーNB9601型）。エチジウムブロミドで染色後、泳動像を撮影する。
5） 得られたPCRシグナルの座標（x、y、z）からキット上のラベルのプレート番号表から番号を読取り、レプリカプレートを請求する（代理店、またはGenoTechs：Fax.029-849-2567）。
6） レプリカ・プレートはドライアイスで凍結状態で送付されるので、到着次第冷凍庫に保存する。送付されたMTPは、弊社のPCRスクリーニングプレートを使用し、クローンを単離してください。

３. 第二ラウンドPCR（クローン番号の確定）
1） クローン選択システムから縦・横溝プレートを取り出し、3mlのパスツールピペット（Benton Dickenson #BDL4642)で抗生物質が入ったLB培地を加える。次に、 送付されたプレートを冷凍庫から取り出し、無菌室で蓋を開けて解凍する。
2） 2枚のレプリカ・ピンでレプリカプレートからそれぞれ縦、横溝プレート に接種する。
3） 付属の粘着シートが皺がよらないように強く貼り、溝中央に注射針でガス抜き孔をつけ、37℃で一晩培養する。
4） 50回分のPCRカクテルを作製し（表１）、20ul ずつをPCRチューブに分注する。
5） 縦、横溝プレートのガス抜き孔に妻楊枝を立て、プレートを傾け、プレートを傾け菌をよく混ぜる。
6） 菌のついた妻楊枝を溝から順番に出し、20ulのカクテルの入ったPCRチューブに順番に立て、妻楊枝を取り除く。
7） 同封したPCR粘着シートをプレートに密着させ、第一ラウンドと同じ条件でPCR反応を行ない、そのシグナルからプレート中の座標を決め、クローン番号を確定する。


表１　 PCRカクテル（反応液）の調製法（ABI社　Ampll Taq Gold使用)

反応液数	1回分	10回分	50回分	100回分
10xBuffer II	2 ul	20 ul	100 ul	200 ul
25 mM Mg(0Ac)2	2	20	100	200
2.5 mM dNTP mix	2	20	100	200
正プライマー（10 pmol/ul)	1	10	50	100
負プライマー（10 pmol/ul)	1	10	50	100
Taq Gold (5U/ul)	0.1	1	5	10
H2O	11.9	119	595	1190
合計	20	200	1000	2000

[価格]

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